ELISA檢測方法
 

　　一、elisa直接法
 

　　直接ELISA法是將抗原固定在96孔板上，然后用酶標(biāo)抗體直檢測抗原。直接ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少，檢測速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反應(yīng)，測定結(jié)果不容易出錯(cuò)。但是由于直接ELISA的抗原通過吸附而不是特異性固定的，樣本中的所有蛋白質(zhì)(靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白)都會(huì)固定在96孔板上，導(dǎo)致背景比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要標(biāo)記與其特異性結(jié)合的一抗，實(shí)驗(yàn)顯得不太靈活。另外由于沒有使用二抗，沒有放大作用，降低了測定的靈敏度。
 

　　優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)步驟少，檢測速度快，因無須使用二抗可避免交互反應(yīng)。
 

　　缺點(diǎn)：試驗(yàn)中的一抗都得用酶標(biāo)記，但不是每種抗體都適合做標(biāo)記，費(fèi)用相對(duì)提高。
 

　　二、Elisa間接法
 

　　在直接法的基礎(chǔ)上，Lindström 和Wager 引入二抗建立了間接 ELISA 方法，通過使用一抗能結(jié)合多個(gè)二抗，從而放大了檢測靈敏度，同時(shí)，不需要標(biāo)記一抗，只需要加入抗一抗種屬的標(biāo)記二抗就可以進(jìn)行檢測，克服了直接法的局限性。
 

　　優(yōu)點(diǎn)：只要更換不同的固相抗原，就可以用標(biāo)記二抗檢測各種與抗原相結(jié)合的抗體，二抗可以加強(qiáng)信號(hào)，不加標(biāo)記一抗體則能保留一抗最多的免疫反應(yīng)性。
 

　　缺點(diǎn)：存在交叉反應(yīng)的可能性，抗原純度不夠會(huì)導(dǎo)致非特異結(jié)合，產(chǎn)生假陽性。
 

　　三、Elisa夾心法
 

　　雙抗體夾心法將捕獲抗體固定在96孔板上，加入樣品，通過捕獲抗體結(jié)合目標(biāo)抗原，洗去未結(jié)合的雜質(zhì)后，加入酶標(biāo)檢測抗結(jié)合目標(biāo)抗原的另一表位(如果檢測抗體不帶有標(biāo)記，則需使用酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合，這種稱為間接夾心ELISA)，形成“sandwich” 的結(jié)構(gòu)，此時(shí)的抗原就像被兩個(gè)面包片夾著的奶油，通過酶催化發(fā)生顯色反應(yīng)就可以測定抗原的含量。雙抗體夾心法測抗原，對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為捕獲抗體和酶標(biāo)檢測抗體。適用于測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，不適用于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。
 

　　優(yōu)點(diǎn)：高靈敏、高專一性，抗原無須事先純化，進(jìn)行操作時(shí)不需稀釋，夾心ELISA尤其適用于復(fù)雜樣品的分析，因?yàn)榭乖唤?jīng)純化仍具能有高靈敏度和特異性。
 

　　缺點(diǎn)：抗原分子上需擁有兩個(gè)不同抗原決定簇，對(duì)配對(duì)抗體要求很高，如果沒有標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒或者已經(jīng)通過測試的配對(duì)抗體，則需要進(jìn)行配對(duì)抗體定制并進(jìn)行優(yōu)化，因?yàn)榻档筒东@抗體與檢測抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的。
 

　　四、Elisa競爭法
 

　　競爭法是所有ELISA 里最為復(fù)雜的測試方法，通過檢測競爭信號(hào)的強(qiáng)度來反應(yīng)樣品中的抗原水平，通常以酶標(biāo)抗原作為競爭抗原，與樣品來源的抗原形成直接競爭，搶奪過量的固定化抗體上的結(jié)合位點(diǎn)，因此競爭信號(hào)越高，說明樣品中的抗原越少。競爭法ELISA既可用于檢測抗體，也可用于檢測抗原。
 

　　優(yōu)點(diǎn)：可用于檢測不純的樣品，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高，特異性好。
 

　　缺點(diǎn)：操作方法更復(fù)雜一些，產(chǎn)品性能取決于抗體的親和力。整體的敏感性和專一性都較差。
 

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